DNA熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization，FISH)技術是一種應用非放射性熒光物質依靠核酸探針雜交原理在核中或染色體上顯示DNA序列位置的方法[1]。該技術具有快速、安全、靈敏度高以及探針可長期保存等特點，目前已廣泛應用于細胞遺傳學、腫瘤生物學、基因定位、基因作圖、基因擴增,產前診斷及哺乳動物染色體進化研究等領域。
　　
　　1FISH技術的產生
　　
　　1969年Gall和Pardue利用放射性同位素標記的DNA探針檢測細胞制片上非洲爪蟾細胞核內的rDNA獲得成功之后，Pardue等同年又以小鼠衛星DNA為模板，利用體外合成的含3H的RNA為探針成功地與中期染色體標本進行了原位雜交，從而開創了RNA-DNA的同位素原位雜交技術[2]，但是沒有得到廣泛應用。1974年Evans*次將染色體顯帶技術和原位雜交技術結合起來，提高了基因定位的準確性。1981年，Langer等采用生物素標記的核苷酸探針(bio-dUTP)成功地進行了染色體原位雜交，建立了非放射性原位雜交技術(Nonisotopicinsituhybridization)，至此，以熒光標記的探針在細胞制片上進行基因原位雜交的技術建立起來。1985年這項技術被引進到植物。1986年，Cremer與Licher等分別證實了熒光原位雜交技術應用于間期核檢測染色體非整倍體的可行性，從而開辟了間期細胞遺傳學研究。
　　
　　2FISH的原理
　　
　　熒光原位雜交技術原理是將DNA探針用生物素和毛地黃毒苷等熒光染料標記，然后將標記的探針直接原位雜交到染色體或DNA纖維切片上，再用與熒光素分子偶聯的單克隆抗體與探針分子特異結合，通過熒光雜交信號來檢測DNA序列在染色體或DNA纖維上的定位、定性、相對定量分析。與其他原位雜交技術相比，熒光原位雜交具有很多優點，主要體現在：①FISH不需要放射性同位素作探針標記，安全性高;②FISH的實驗周期短，探針穩定性高;③FISH能通過多次免疫化學反應，使其雜交信號明顯增強，從而提高靈敏度，檢測的靈敏度接近同位素探針雜交;④FISH的分辨率高達3-20Mb;⑤FISH可以用不同修飾核苷酸分子標記不同的DNA探針，再用不同的熒光素分子檢測不同的探針分子，因此可以在熒光顯微鏡下在同一張切片上同時觀察幾種DNA探針的定位，直接得到它們的相關位置和順序，從而大大加速生物基因組和功能基因定位的研究。
　　
　　3FISH技術的發展
　　
　　在20世紀90年代，FISH在方法上逐步形成了從單色向多色、從中期染色體FISH向粗線期染色體FISH再向fiber-FISH的發展趨勢，靈敏度和分辨率也有了大幅度的提高。
　　
　　3.1多色熒光原位雜交(M-FISH)
　　
　　多色原位雜交(M-FISH)，“M”分別代表“Multicolor”、“Multiplex”和“Multitarget”3種類型。M-FISH的zui大特點是：可將多次繁瑣的FISH實驗和多種不同基因的定位在一次FISH實驗中完成。Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰熒光素(AFA)標記探針建立了雙色FISH技術。1990年Nederlof等提出用3種熒光素探測3種以上的靶位DNA序列，創建了多色FISH方法。以下五種方法是在多彩色FISH基礎上發展起來的新技術：染色體描繪(chromosomepainting)、比較基因組雜交(comparativegenomichybridization,CGH)、光譜染色體自動核型分析(spectralkaryotyping,SKY)、交叉核素色帶分析(cross-speciescolorbanding,Rx-FISH)、多彩色原位啟動標記(multicolorprimedinsitulabeling,multicolorPRINS)[5]。
　　
　　3.2DNA纖維熒光原位雜交技術(DNAfiber-FISH)
　　
　　Wiegant等和Heng等首先利用化學方法染色體進行線性化，再以此線性化的染色體DNA作為載體進行FISH，使FISH的分辨率顯著提高，就是zui初的纖維-FISH。Parra和Windle(1993)，Heiskanen等(1994)，Florijn等(1995)，進一步改進了伸展DNA纖維的方法，使DNA纖維的伸展程度從zui初的80kb/μm達到了現在的2.5-3.5kb/μm，這一數值與Watson-Crick建立的DNA雙螺旋模型中B-DNA分子的理論值2.97kb/μm十分接近，因此可以說現在得到的DNA纖維基本上是裸露的雙螺旋DNA分子。纖維-FISH的關鍵就在于何制備高質量的線性DNA纖維纖維-FISH具有高分辨率,能進行定量分析，模板要不高，只需分析少量的DNA分子(<10個)，靈敏度高等優點由于纖維-FISH的這些優點使得它在染色體圖譜繪制，基因重組研究以及臨床染色體基因序列檢測工作中起著十分重要的作用[1]。
　　
　　3.3組織微陣排列技術(tissuemicroarray)
　　
　　Microarray可以在1次實驗中檢測出數百個基因在1個細胞中的表達情況(包括降低和增高)。Tissuearray則在1次實驗中能檢測出1個基因在數百個細胞中的表達情況。Tissuemicroarray是由Tissuemicroarray區域中500-1000單個腫瘤組織聯合筒狀活檢構成的，將活檢組織切成200多片用于DNA、RNA探針。單個雜交提供單個載玻片上所有樣本的信號，以后的切片可以用其他探針或抗體分析。同一個組織樣本切片的多重疊區域可以形成數千張切片。組織和cDNA微陣排列技術相結合提供一種有力的體內鑒定基因的方法，可以對癌或其他疾病的分子改變做出重要評估。
　　
　　3.4熒光免疫核型分析和間期細胞遺傳學(fluorescenceimmunophenotypingandinterphasecytogenetics,FICTION)
　　
　　FICTION是1種將免疫核型分析和原位雜交相結合的方法，這種方法可以同時顯示異種細胞群中單個腫瘤細胞的免疫表型和一定的基因改變。FICTION形態學有關，可以對檔藏材料作回顧性研究。FICTION診斷快速，可以再現，適合FISH分析前或后沒有所需以前細胞標本的細胞學樣本。FICTION可用于分析血液腫瘤的系譜以獲得對腫瘤病理組織更好的了解。
　　
　　4FISH技術的應用
　　
　　FISH技術已經在細胞遺傳學、腫瘤生物學、基因定位、基因作圖、基因擴增、產前診斷及哺乳動物染色體進化研究等領域得到了廣泛應用。
　　
　　4.1染色體結構變異與非整倍體的檢測
　　
　　熒光原位雜交簡化了染色體結構變異的檢測。如植物染色體的非整倍體是由于染色體行為異常，即可能是雙親配子染色體數目和結構差異引起或染色體親緣關系較遠等因素導致。利用原位雜交可比較容易地檢測出缺失、附加或替換的染色體。
　　
　　4.2基因擴增和缺失的檢測
　　
　　FISH空間分辨率和敏感性使得親本和擴增基因在抗病蟲害細胞中定位成為可能。被擴增基因主要在同一染色體臂上，但離初始親本基因有一定距離，且經常獨立地位于染色體端粒部位;FISH分析表明細胞斷裂可能是由于染色體含有擴增區域的結構重排。同時用FISH可定位轉基因植物中外源基因位置和拷貝數，此法在番茄、煙草、大麥、小麥、黑麥等作物中已獲成功。利用FISH技術也可檢測一些與遺傳性疾病相關的基因缺失，如成功檢測了aniridia疾病(一種虹膜缺失的罕見遺傳異常疾病)患者的缺失基因。
　　
　　4.3基因定位
　　
　　熒光原位雜交的基因定位技術有著廣泛的應用。PP2Ac突變型肺癌相關基因在染色體區域的定位，熒光顯微鏡下觀察記錄和分析雜交信號的特征。結果在正常人淋巴細胞的染色體5q23-31可見明顯雜交信號，在GLC-82細胞的5號和7號染色體上出現較強信號。說明點突變引起PP2Ac活性改變，從而基因易位，導致肺腫瘤的產生。FISH技術與生化、計算機和重組DNA技術結合檢測Alu位點，表明DNA序列與帶型有關。用FISH技術對人類基因組中編碼基因分布的研究揭示，基因主要集中在染色體上G+C(占全基因組35%)zui豐富的DNA區段。FISH技術為著絲粒結構研究提供了重要手段。應用FISH技術可直接觀察染色體端粒，這簡化了染色體在核內的結構和功能研究。
　　
　　4.4基因作圖
　　
　　用FISH技術可直接檢測DNA在染色體上的位置，所確定位置是基因在染色體上實際的物理位置。由于原位雜交不受位點內變異和位點間拷貝數的影響，FISH技術已成為重復序列和多基因家族作圖的重要手段，如M.Clark等用熒光原位雜交方法在大麥第5號染色體制作出B-醇溶蛋白位點的物理圖譜。多色探針標記為探針定位提供了一種更簡便的方法。如檢測時2個探針用紅色，第3探針用綠色，則綠色位點的位置要么在2紅色位點之外，要么在它們之間，于是可確定探針順序。因此，探針被至少20kbp的序列隔開就可以用FISH技術將之定位。
　　
　　4.5產前診斷
　　
　　FISH技術zui先在美國用于產前診斷，早在1993年FISH技術就被美國遺傳學會(ACMG)允許用于產前輔助診斷，zui終的確診還需要依賴核型分析。而到2000年鑒于FISH技術具有高度的敏感性和特異性，ACMG宣布FISH技術可以用于常見染色體數目異常的確診，而不再僅僅作為輔助性產前診斷手段。在2001年，Tepperberg等對FISH技術進行快速產前診斷的結果與核型分析結果進行了大樣本比較，共47312份有效標本中，FISH法僅有9例出現了假陽性結果，假陽性率為0.019%，有32例出現了假陰性結果，假陰性率為0.049%。FISH進行快速產前診斷具有非常高的靈敏度和特異度，可以用于常見的染色體數目異常的診斷。此后，FISH技術在一些發達國家被廣泛用于快速產前診斷。
　　
　　FISH適用于多種標本：如羊水細胞、絨毛細胞、胎兒有核紅細胞及著床前胚胎卵裂細胞等，且不僅適用于中期染色體，也適用于間期核及細胞周期的所有階段。FISH的突出優點是可快速得出結果，與歷時7～12d的細胞培養進行傳統染色體顯帶分析相比，FISH可在24～48h內完成，減少染色體病篩查試驗陽性患者在焦慮中的等待時間，讓臨床醫生盡早做出診斷，制定進一步診療方案。與放射性原位雜交相比較，FISH技術無放射性同位素污染，不需要特殊的安全防護，且敏感性與同位素檢測相當，*可以取代放射性原位雜交而成為一種新的檢查方法。
　　
　　4.6染色體RNA和基因組進化研究
　　
　　染色體的主要成分包括DNA和組蛋白，除此之外，還有非組蛋白和RNA。對這些物質在染色體中分布進行定位是研究染色體結構和構建染色體模型的關鍵所在。人們對染色體中DNA和蛋白質研究已比較深入，但對染色體中RNA的性質、種類、來源、分布特點及生物學功能缺乏深入研究。宋林生等[15]用生物素標記的玉米18s、rRNA小麥5srRNA及tRNA的cDNA作為探針，利用玉米根尖超薄切片進行原位雜交，證實玉米染色體中既有來自核仁的rRNA或其前體，又含有來自核基質的rRNA、5srRNA或hnRNA(核內不均一RNA)，揭示了染色體中RNA的種類和來源。
　　
　　4.7血液腫瘤檢測
　　
　　血液腫瘤是我國高發腫瘤之一，隨著對疾病發病機制的深入研究，發現細胞遺傳學對腫瘤分型、診斷、治療和預測預后都具有重要的意義。在臨床上對血液腫瘤的FISH檢測主要集中在以下幾個方面：①染色體異位形成的融合基因檢測。②基因缺失的檢測。一些關鍵基因的缺失有助于我們對腫瘤進行診斷以及預后判斷。③微小殘留病灶的檢測。④對異性間造血干細胞移植的植入狀態監測。
　　
　　4.8在實體瘤中的應用
　　
　　FISH幾乎可以快速檢測任何類型組織細胞的染色體異常，不管組織是新鮮的或是一些甲醛溶液(福爾馬林)固定的陳舊組織標本。因此，FISH被廣泛接受用于乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、肺癌、淋巴瘤等實體瘤的輔助診斷，其目的主要集中在對腫瘤的早期診斷、療效檢測、個體化治療和預后判斷等幾個方面。
　　
　　總之，FISH技術在臨床中的應用已經得到迅速的發展，靈敏度和特異度明顯改善，可供選擇的商業化探針也越來越多。但是，由于目前儀器設備和探針價格過于昂貴，以及對于操作人員技術水平要求也較高，在一定程度上限制了FISH技術在臨床上的應用。特別是在我國，僅有一些大醫院開展了FISH項目，檢測范圍也于血液性腫瘤、乳腺癌以及產前診斷方面，其他檢測項目開展較少。因此，在今后的一段時間，為了使FISH得到更廣泛的應用，怎樣降低成本，簡化操作步驟仍是科研人員面臨的一個難題。