一.細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)
　　
　　將液氮或-80℃保存的腫瘤細(xì)胞于37℃水浴，快速溶化，用8.0ml培養(yǎng)基混勻已融化的腫瘤細(xì)胞懸液，于1500轉(zhuǎn)/分，離心3分鐘。棄上清，再吸取8.0ml培養(yǎng)基質(zhì)混勻細(xì)胞沉淀，再1500轉(zhuǎn)/分，離心3分鐘，棄上清，細(xì)胞沉淀用1.0ml培養(yǎng)基混勻，備用。另取一個(gè)75cm2方瓶，加入14.0ml培養(yǎng)基質(zhì)，將上述制備的含腫瘤細(xì)胞懸液(1.0ml)加入此方瓶中，于37℃，5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。
　　
　　若此腫瘤細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，大約3－4天細(xì)胞基質(zhì)會(huì)變黃，5.0ml細(xì)胞懸液可傳代一個(gè)方瓶培養(yǎng)，可用3－4個(gè)方瓶培養(yǎng)，一個(gè)方瓶中呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞可達(dá)1-1.5×107個(gè)，根據(jù)試驗(yàn)所需，可決定傳代的次數(shù)。若此腫瘤細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)3-4天，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-95%單層時(shí)，棄上清，用0.5mM的EDTA(難消化的腫瘤細(xì)胞用0.25%胰酶1.0ml)，處理腫瘤細(xì)胞大約3-5分鐘，用倒置顯微鏡觀察，當(dāng)90%的腫瘤細(xì)胞變圓時(shí)，即可用彎管吹打并將消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，于1500轉(zhuǎn)/分下，離心3分鐘，棄上清，加少許培養(yǎng)基混勻，可傳代3個(gè)75cm2方瓶擴(kuò)大培養(yǎng)。
　　
　　二.細(xì)胞凍存
　　
　　將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞用1個(gè)75cm2方瓶按上述方法收集，于1500轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，棄上清，用保種液(含10%DMSO的小牛血清)3.0ml混勻，分別加入到2-3只保種管中，寫(xiě)上腫瘤細(xì)胞名稱、時(shí)間、保種者姓名，放-80℃保存，次日將它們轉(zhuǎn)移到液氮中保存(注：-80℃下可保存細(xì)胞半年至一年，液氮可保存細(xì)胞5-10年，甚至更長(zhǎng)的時(shí)間)。以上所有物品均需經(jīng)過(guò)高溫滅菌(121℃，30分鐘)，培養(yǎng)基質(zhì)則經(jīng)過(guò)過(guò)濾(0.22uM)除菌，所有操作均必須遵守?zé)o菌操作技術(shù)，避免細(xì)菌、真菌、病原體、衣原體等污染。